Leitfaden für PCR RTPCR und Qpcr Techniken erklärt

Sind Sie jemals durch die Begriffe "PCR", "RT-PCR" und "qPCR" im Labor verwirrt?Ihnen helfen, Ihre Recherche effektiver zu navigieren.

Diese grundlegende molekulare Biologie-Technik, erfunden von Kary Mullis, verstärkt die Ziel-DNA-Sequenzen in vitro,Millionen bis Milliarden Kopien innerhalb weniger Stunden produziertPCR ist für das Genklonen, die DNA-Sequenzierung, die Krankheitsdiagnose und zahlreiche andere Anwendungen unerlässlich.

Der PCR-Prozess besteht aus drei sich wiederholenden Schritten, die eine exponentielle DNA-Amplifikation ermöglichen:

1. Denaturierung:Hohe Temperaturen (94-98°C) trennen doppelsträngige DNA in einzelne Stränge.
2. Brennen:Durch die Temperaturreduktion (50-65°C) können sich Primare an komplementäre Zielsequenzen binden.
3. Verlängerung:DNA-Polymerase (typischerweise Taq-Polymerase) synthetisiert bei 72°C neue komplementäre Stränge.

Nach 25-40 Zyklen kann die verstärkte DNA mit Hilfe einer Agarose-Gel-Elektrophorese visualisiert werden.

Quantitative PCR (qPCR) oder Echtzeit-PCR baut auf herkömmlicher PCR auf, indem Fluoreszenzdetektion zur Überwachung der Verstärkung in Echtzeit verwendet wird, während die anfängliche Menge der DNA-Vorlage quantifiziert wird.

Es gibt zwei primäre Fluoreszenzdetektionsmethoden:

• DNA-bindende Farbstoffe (z. B. SYBR Grün):Kostengünstig, aber unspezifisch, bindet alle doppelsträngigen DNA.
• Fluoreszierende Sonden:Ziel-spezifisch, aber teurer, erfordert maßgeschneiderte Sonden.

Die wichtigste qPCR-Metrik ist der Ct-Wert (Schwellenzyklus) – die Zyklenzahl, wenn die Fluoreszenz einen definierten Schwellenwert überschreitet.

Zu den Anwendungen gehören:

• Analyse der Genexpression
• Erkennung von Krankheitserregern
• Drogenuntersuchung
• Krebsforschung

Reverse Transcription PCR (RT-PCR) konvertiert zunächst RNA in komplementäre DNA (cDNA) mithilfe von Reverse-Transkriptase, verstärkt dann die cDNA über Standard-PCR. Dies ermöglicht die RNA-Analyse, einschließlich:

• Studien zur Genexpression
• Nachweis von RNA-Viren (z. B. HIV, Grippe)
• RNA-Struktur/Funktionsforschung

Echtzeit-Quantitative RT-PCR kombiniert Reverse Transcription mit qPCR, um die RNA-Expressionswerte zu quantifizieren.

• Genaue Messung der Genexpression
• Quantifizierung von microRNA
• Lange nicht kodierende RNA-Studien

qPCR erfordert sorgfältig entworfene Primer und Sonden, um die Spezifität zu gewährleisten. Fehlentscheidungen können zu falschen Ergebnissen führen.

Verschiedene Enzyme (z. B. AMV, M-MLV) unterscheiden sich in ihrer thermischen Stabilität und Effizienz und beeinflussen die Ausbeute von cDNA.

Nichtspezifische Verstärkung kann durch optimierte Glühtemperaturen und hochfidele Polymerasen minimiert werden.

Durch das Verständnis der Unterschiede zwischen diesen molekularen Techniken können die Forscher geeignete Methoden für ihre spezifischen Versuchsbedürfnisse auswählen und so genaue und zuverlässige Ergebnisse erzielen.