Interpretation der Prinzipien der RTPCR-Testung und COVID-19-Risiko

Da die COVID-19-Pandemie weiterhin globale Herausforderungen mit sich bringt, bleibt der RT-PCR-Test (Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion) der Goldstandard für die Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion. Aber wie viele verstehen wirklich die wissenschaftlichen Prinzipien hinter diesem entscheidenden Diagnostikum? Dieser Artikel bietet eine detaillierte, aber zugängliche Erklärung des RT-PCR-Tests und hilft sowohl medizinischem Fachpersonal als auch der Öffentlichkeit, diese wichtige Technologie besser zu verstehen.

RT-PCR, oder Real-Time Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion, ist eine hochempfindliche und schnelle molekularbiologische Technik, die verwendet wird, um spezifisches genetisches Material in Proben nachzuweisen. Dieses genetische Material kann von Menschen, Bakterien oder Viren wie SARS-CoV-2 stammen.

Die Kerntechnologie hinter RT-PCR ist PCR, die in den 1980er Jahren von Kary B. Mullis erfunden wurde (was ihm einen Nobelpreis einbrachte). PCR amplifiziert und detektiert spezifische DNA-Ziele. Spätere Verbesserungen ermöglichten die „Echtzeit“-Visualisierung und Quantifizierung von DNA-Zielen während der Amplifikation. Bei der Real-Time-PCR korreliert die Fluoreszenzintensität von spezialisierten Sonden mit der Menge an amplifizierter DNA.

Standard-PCR detektiert jedoch nur DNA. Da SARS-CoV-2 RNA-genetisches Material enthält, erfordert der Test das Enzym Reverse Transkriptase, um RNA in komplementäre DNA (cDNA) umzuwandeln. Dieser Reverse-Transkriptionsschritt, kombiniert mit Real-Time-PCR, macht RT-PCR zu einem leistungsstarken Werkzeug zum Nachweis von RNA-Viren wie SARS-CoV-2.

Das Verständnis von RT-PCR erfordert Grundkenntnisse über genetisches Material – die Bedienungsanleitung, die das zelluläre und virale Verhalten, das Überleben und die Reproduktion steuert. Genetisches Material gibt es in zwei Hauptformen: DNA (Desoxyribonukleinsäure) und RNA (Ribonukleinsäure). DNA weist eine doppelsträngige Struktur auf, während RNA einzelsträngig ist. Für diagnostische Zwecke ist die größere Stabilität der DNA für Tests auf Infektionskrankheiten vorzuziehen. Insbesondere enthält SARS-CoV-2 nur RNA.

Alle Viren teilen die Eigenschaft, für das Überleben und die Replikation auf Wirtszellen angewiesen zu sein. SARS-CoV-2 dringt, wie andere Viren auch, in gesunde Zellen ein, um sich zu vermehren. Wenn eine Infektion auftritt, setzt das Virus seine RNA frei und kapert die zelluläre Maschinerie zur Replikation. Solange virales genetisches Material in den Zellen verbleibt, kann RT-PCR eine SARS-CoV-2-Infektion nachweisen.

Ausgebildete Angehörige der Gesundheitsberufe entnehmen nasopharyngeale Tupferproben, die dann in sterile Röhrchen mit viralem Transportmedium gegeben werden, um die virale Integrität zu erhalten.

Im Labor extrahieren Forscher RNA mit kommerziellen Reinigungskits. Die RNA-Probe wird dann zu einer Reaktionsmischung gegeben, die alle für den Test erforderlichen Komponenten enthält, einschließlich DNA-Polymerase, Reverse Transkriptase, DNA-Bausteine sowie SARS-CoV-2-spezifische Fluoreszenzsonden und -primer.

Da PCR nur mit DNA-Matrizen funktioniert, wandelt die Reverse Transkriptase die gesamte RNA in der Probe (einschließlich menschlicher, bakterieller, anderer Coronavirus-RNA und potenziell SARS-CoV-2-RNA) in cDNA um.

Dieser Prozess umfasst drei sich wiederholende Schritte:

• Denaturierung: Das Erhitzen von DNA auf >90 °C für etwa 10 Minuten trennt doppelsträngige DNA in Einzelstränge.
• Primer-Anlagerung: Speziell entwickelte kurze DNA-Fragmente (Primer) lagern sich bei niedrigeren Temperaturen an spezifische SARS-CoV-2-cDNA-Ziele an. Häufige COVID-19-Gen-Ziele sind RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRP), ORF1ab, S-Gen (Spike-Protein), N-Gen (Nukleokapsid) und E-Gen (Hülle).
• Extension: DNA-Polymerase verwendet Primer als Ausgangspunkte, um identische Kopien von Ziel-DNA-Segmenten zu erstellen.

Der Prozess wiederholt sich typischerweise 40 Mal und verdoppelt dabei die Ziel-DNA mit jedem Zyklus. Fluoreszierende Sonden binden stromabwärts von Primern und setzen mit jeder DNA-Amplifikation nachweisbare Signale frei. Die Zunahme der Ziel-DNA korreliert mit einer steigenden Fluoreszenzintensität.

Die Fluoreszenzdaten erzeugen einen „Zyklusschwellenwert“ (Ct-Wert) – die Anzahl der Zyklen, die erforderlich sind, damit das Signal die Hintergrundwerte übersteigt. Proben mit mehr Ziel-DNA amplifizieren schneller und benötigen weniger Zyklen (niedrigere Ct-Werte). Umgekehrt erfordert spärliche Ziel-DNA mehr Zyklen (höhere Ct-Werte).

Ct-Werte liefern wichtige Informationen über die Viruslast. Niedrigere Ct-Werte weisen auf höhere Mengen an viralem Genom hin, während höhere Werte auf geringere Mengen hindeuten. Angehörige der Gesundheitsberufe kombinieren Ct-Werte mit klinischen Symptomen und der Anamnese, um das Krankheitsstadium zu beurteilen. Serielle Ct-Werte aus wiederholten Tests helfen, den Krankheitsverlauf zu überwachen und die Genesung vorherzusagen. Kontaktverfolger verwenden auch Ct-Werte, um Patienten mit der höchsten Viruslast (und damit dem größten Übertragungsrisiko) zu priorisieren.

• Viruslast: Ct-Werte korrelieren umgekehrt mit der Viruslast – niedrigerer Ct-Wert bedeutet, dass mehr Virus vorhanden ist.
• Krankheitsstadium: Eine frühe Infektion zeigt typischerweise hohe Viruslasten (niedriger Ct-Wert), während spätere Stadien abnehmende Lasten (steigender Ct-Wert) aufweisen, wenn das Immunsystem die Infektion beseitigt.
• Übertragungsrisiko: Höhere Viruslasten (niedrigere Ct-Werte) weisen auf ein höheres Übertragungspotenzial hin, was strengere Isolationsmaßnahmen rechtfertigt.

Obwohl RT-PCR der diagnostische Goldstandard von COVID-19 ist, hat er Einschränkungen:

• Falsch-Negative: Unsachgemäße Probenentnahme, niedrige Viruslasten oder frühe Tests können trotz tatsächlicher Infektion negative Ergebnisse liefern.
• Falsch-Positive: Seltene, aber mögliche positive Ergebnisse ohne tatsächliche Infektion.
• Standardisierungsprobleme: Verschiedene Labore und Plattformen können unterschiedliche Ct-Schwellenwerte verwenden, was Vergleiche erschwert.

RT-PCR-Tests sind nach wie vor unerlässlich für die COVID-19-Diagnose, indem sie SARS-CoV-2-genetisches Material nachweisen. Ct-Werte dienen als wichtige Indikatoren für Viruslast, Krankheitsverlauf und Übertragungsrisiko. Einschränkungen des Tests machen es jedoch erforderlich, die Ergebnisse mit einer klinischen Bewertung zu kombinieren, um eine genaue Diagnose und Behandlung zu gewährleisten.