Blog über Schlüsselprinzipien und Fehlerbehebung für Nucleinsäure-Extraktionskits

Die Extraktion von Nukleinsäuren dient als Eckpfeiler molekularbiologischer Experimente.Viele Forscher sind verwirrt, insbesondere bei der Fehlerbehebung unerwarteter Ergebnisse. This article demystifies the scientific principles underlying nucleic acid extraction kits while providing practical troubleshooting guidance to transform this essential technique from a "black box" operation into a predictable, effiziente Prozesse.

Die meisten kommerziellen Nukleinsäure-Extraktionskits verwenden Silikamembran-Spin-Spalte-Technologie mit fünf kritischen Stufen: Zelllysis, Nukleinsäurebindung, Waschen und Reinigung, Trocknen,und EndelutionJeder Schritt baut auf dem vorherigen auf, was bedeutet, dass jeder falsche Schritt die gesamte Extraktion gefährden kann.

Eine wirksame Zelllysis ist der entscheidende erste Schritt.aber enthalten typischerweise hohe Konzentrationen von chaotropen Salzen, die zwei Zwecke erfüllen:

• Proteindenaturation:Diese Salze stören Wasserstoffbindungen, Van der Waals-Kräfte und hydrophobe Wechselwirkungen und destabilisieren Proteine (einschließlich Nukleasen), um den Abbau von Nukleinsäuren zu verhindern.
• Erleichterung der Silikonbindung:Chaotrope verdrängen Wassermoleküle von Nukleinsäuren und schaffen optimale Bedingungen für die Übertragung auf Siliciummembranen.

Zu den häufigsten chaotropen Salzen gehören Guanidinhydrochlorid, Guanidinthiocyanat, Harnstoff und Lithiumperchlorat.Je nach MusterartProteinase K verdaut Proteine in Nukleinsäurepräparaten effektiv, insbesondere unter Denaturierungsbedingungen.Obwohl seine Aktivität unter denaturierenden Bedingungen abnimmt.

Die Plasmidenextraktion unterscheidet sich erheblich von der RNA- oder genomischen DNA-Isolation.Wenn man sofort chaotropische Salze hinzufügt, werden alle DNA-Typen wahllos freigesetzt.Daher führen Plasmidprotokolle typischerweise nach der ersten Zelllysis Chaotrope ein.

Neben der Lyse erleichtern chaotrope Salze die Bindung von Nukleinsäuren an Siliziumsäulen. Ethanol (oder manchmal Isopropanol) verbessert diese Bindung.Silikonsäulen enthalten Harz, das je nach Salzgehalt und anderen Faktoren selektiv an DNA oder RNA bindetDie daraus resultierenden Nukleinsäuren weisen eine hohe Reinheit auf und eignen sich für das Klonen, die Sequenzierung mit langen Lesezeiten und andere Anwendungen.

Die Ethanolkonzentration erweist sich als kritisch. Überschüssiges Ethanol setzt abgebautes Material und kleine Moleküle aus, was die Absorptionswerte von A260 beeinträchtigt.Unzureichendes Ethanol kann die Salzabnahme von Membranen behindernDie mit dem Kit bereitgestellten Ethanolmengen sind voroptimiert, aber wenn die degradierte DNA die A260-Werte scheinbar verzerrt, kann eine erneute Optimierung der Ethanolkonzentration hilfreich sein.Durchflusslösungen können für die Niederschlagung zur Wiederherstellung verlorener Nukleinsäuren gespeichert werdenWenn bei der Lyse mit SDS-haltigen Reinigungsmitteln gearbeitet wird, dient NaCl als wirksames Ausfällungsmittel, das eine Kontamination des Reinigungsmittels verhindert.

Nach der Zentrifugation des Lysates durch Siliciummembranen binden sich die Zielnukleinsäuren an die Säulen, während Proteine und Polysaccharide im Durchfluss bleiben.Die Membranen behalten Restproteine und Salze.Pflanzenproben können Polysaccharide und Pigmente hinterlassen; Blutproben erzeugen häufig eine braun- oder gelbfarbene Verfärbung.

Zwei Wäsche sind typisch, obwohl die genaue Anzahl von der Probeart abhängt.gefolgt von Ethanolwäschen zur Beseitigung der Salze. Proben, die anfangs wenig Proteine enthalten (z. B. Plasmidvorbereitungen oder PCR-Produktreinigung), müssen möglicherweise nur mit Ethanol gewaschen werden.Einige Kits empfehlen eine doppelte EthanolwäscheRestsalze hemmen die Elution, reduzieren den Ertrag und erhöhen die A230-Werte, was die A260/230-Verhältnisse unterdrückt.

Die meisten Verfahren umfassen die Zentrifugation nach dem Waschen, um restliches Ethanol aus den Säulen zu trocknen.Hinzufügen von 10 mM Tris-Puffer oder Wasser, dann rehydriert man die Nukleinsäuren zur Freisetzung der MembranResiduale Ethanol verhindert die vollständige Rehydrierung und Elution.Hinweisende Anzeichen sind, dass sich die Proben nicht in Agarose-Gel-Brunnen absetzen (auch bei Vorhandensein eines Farbstoffs) oder bei -20 °C nicht einfrieren können..

Der letzte DNA-Extraktionsschritt setzt reine Nukleinsäuren aus Kieselsäure frei. Für DNA ist 10 mM Tris bei pH 8-9 Standard.Die DNA bleibt im schwach alkalischen pH-Wert stabiler und löst sich schneller im Puffer als im Wasser aufAuch DNA-Verschüttungen verhalten sich ähnlich. Wasser weist typischerweise einen niedrigeren pH-Wert auf (4-5) und DNA mit hohem Molekulargewicht kann sich möglicherweise nicht schnell vollständig rehydrieren.Lassen Sie den Puffer vor der Zentrifugation mehrere Minuten auf den Membranen sitzenFür Anwendungen, bei denen intakte DNA mit hohem Molekülgewicht erforderlich ist (z. B. lange Sequenzierung), sind Elutionspuffers optimal.Wasser zum bevorzugten Verdünnungsmittel machen.

Selbst nach den üblichen Verfahren können bei Extraktionen verschiedene Probleme auftreten:

• Niedriger Ertrag:Bei der Pufferverwässerung und Bindung werden immer frisches, hochwertiges wasserfreies Ethanol verwendet.Schlechte Qualität oder alter Ethanol kann Feuchtigkeit absorbierenVergessen Sie nicht, daß unzulässig zubereitete Waschpuffer die extrahierten Nukleinsäuren abstreifen können!
• Niedrige Reinheit:Eine Verunreinigung mit Proteinen entsteht häufig durch einen übermäßigen Ausgangsstoff, der das Risiko einer unvollständigen Auflösung erhöht.Verwenden Sie für Waschpuffer Ethanol von höchster Qualität, und wenn Probleme bestehen bleiben, zusätzliche Waschschritte hinzufügen.
• Kontaminanten:Umweltproben erweisen sich besonders anfällig für Humstoffe, die sich mit DNA kopurieren und der Entfernung von Kieselsäure-Säulen widerstehen.Spezielle Techniken können vor der Spaltebindung störende Proteine und Humikstoffe entfernen.
• Abbau:RNA ist mit größeren Abbaurisiken konfrontiert, typischerweise durch unsachgemäße Probenlagerung oder ineffiziente Lyse (vorausgesetzt, RNasefreiwasser wird verwendet).Abbau ist für PCR-Anwendungen weniger wichtig, wird aber für eine lange Lese-Sequenzierung von entscheidender Bedeutung, bei der intakte DNA mit hohem Molekülgewicht erforderlich ist!
• PCR-Produktreinigung:Es handelt sich zwar nicht ausschließlich um DNA-Extraktion, aber es ist erwähnenswert, dass vor der Spin-Säulenreinigung typischerweise pro PCR-Reaktionsvolumen 3-5 Volumen Salzlösung zugesetzt werden.Fehlgeschlagene Reinigungen resultieren in der Regel aus fehlgeschlagener PCR, aber es ist ratsam, den Durchfluss zu sparen. Wenn sich klare PCR-Bänder nicht an die Spalten binden, bleiben sie wahrscheinlich für die Wiederherstellung und erneute Reinigung im Durchfluss.

Eine unvollständige Lyse kann sich in unerwartet niedrigen Erträgen, unvollständiger Proteinauflösung oder schlechten A260/230-Verhältnissen manifestieren.Dies deutet darauf hin, dass bestimmte Probenbestandteile während der Extraktion nicht vollständig gelüsten oder gelöst wurden.Die Unterscheidung zwischen unvollständiger Lyse und Verunreinigung oder Abbau erfordert eine sorgfältige Analyse der Extraktionsbedingungen, einschließlich der Zusammensetzung des Lysepuffers, der Inkubationsparameter,und potenziell störende StoffeSchlechte A260/230-Verhältnisse können beispielsweise eher auf Restsalze nach der Bindung oder unzureichende Waschung als auf unvollständige Lyse hinweisen.Die Behandlung unvollständiger Lyse erfordert möglicherweise die Optimierung von Lysepufferkomponenten., Inkubationszeiten oder mit zusätzlichen mechanischen/enzymatischen Lyseverfahren.

Spezialisierte Verfahren zielen auf die Entfernung von Humusstoffen und anderen Interferenten ab, die mit Nukleinsäuren ko-reinigt werden können.Dazu gehören spezielle Extraktionspuffers, die Chelatstoffe enthalten (z. B..g., EDTA) zur selektiven Bindung und Entfernung von Kationen.Vorbehandlungsverfahren wie Differenzzentrifugation oder Filtration können helfen, vor der Extraktion von Nukleinsäure größere Partikel aus Umweltproben zu entfernen, die Störungen während der Bindungsschritte verringern.

Bestimmte Proben (z. B. Gewebe oder lipidreiche Materialien) stellen besondere Herausforderungen dar.Gewebeproben erfordern häufig eine zusätzliche mechanische Störung oder enzymatische Verdauung, um eine vollständige Lyse und Freisetzung von Nukleinsäuren zu gewährleisten.. Lipidreiche Proben können die Reinigung erschweren, da Lipide die Bindung von Nukleinsäuren an Spaltenmatrizen beeinträchtigen können.Optimierung der Reinigungsprotokolle, oder mit speziell entwickelten Kits.

Ursprünglich veröffentlicht am 28. Juni 2010. Überarbeitet und neu veröffentlicht im Mai 2021 und März 2024.