Lebensmittelsicherheitsschnellen Tests für enterohämorrhagische Escherichia coli EHEC Erkennung mit gefriertrocknetem PCR-Reagenz in Echtzeit

1. BESCHREIBUNG

Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) ist eine Gruppe von E. coli Stämmen, die in der Lage sind, hämorrhagische Diarrhöe und Enteritis beim Menschen zu verursachen, wobei der Serotyp O157:H7 der repräsentativste Stamm ist. Bei lebensmittelbedingten Infektionen umfassen die Kontaminationsquellen Rindfleisch, Rohmilch, Geflügel und dessen Produkte sowie Obst und Gemüse, wobei Rindfleisch das primäre Übertragungsmedium ist.

Dieses Produkt ist ein gefriergetrocknetes Real-Time-PCR-Reagenz für den Nachweis von Escherichia coli O157:H7. Es verwendet das hochkonservierte rfbE Gen von Escherichia coli O157:H7 als Nachweisziel. Es ist ein Mastermix, der alle notwendigen Inhaltsstoffe enthält, mit Ausnahme der Template-DNA, und als Einzeltest in PCR-Röhrchen vorab abgefüllt ist, um die Anwendung zu erleichtern. Dieses Produkt benötigt keine Kühlkette für Transport und Lagerung, was die Versandkosten erheblich senkt und mögliche Verluste durch Reagenzabfall und Aerosolkontamination vermeidet.

2. SPEZIFIKATIONEN & ZUSAMMENSETZUNG

3. LAGERUNG UND HALTBARKEIT

Lagern bei Raumtemperatur (5-30°C). Es ist bis zu 12 Monate haltbar. Nach dem Öffnen der Vakuumverpackung lagern Sie die unbenutzten Produkte bitte in dem mitgelieferten wiederverschließbaren Plastikbeutel mit den Trockenmitteln, und im Aluminiumfolienbeutel. 

VORSICHT: 

Das Schrumpfen des Reagenzpellets ist ein Hinweis auf das Eindringen von Feuchtigkeit in das Röhrchen und die Befeuchtung des Reagenz. Alle Reagenzien mit einer deutlich kleineren Pelletgröße als üblich sollten verworfen oder vor der Verwendung mit der Positivkontrolle getestet werden für die Probenprüfung.   

4. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE GERÄTE & REAGENZIEN

1) Real-Time-PCR-Instrument

2) Pipetten und Spitzen

3) Nuklease-freies Wasser

4) Nukleinsäure-Extraktionskit

5. KOMPATIBLE REAL-TIME-PCR-SYSTEME

ABI 7500/Fast, Roche LightCycler 480II, BioRad CFX96, Bioer LineGene 9600.

6. AKZEPTABLE PROBEN

Nährbouillon für Lebensmittel, Erbrochenes, Durchfallproben usw.

7. VERFAHREN

1) NukleinsäureAcid Extraktion

Extrahieren Sie DNA aus Proben mit einem geeigneten Extraktionskit. Es wird empfohlen, dass die DNA im letzten Schritt der (mit etwa 100 μl Elutionspuffer  (TE₂nukleasefreiem H)O). Die gereinigte Nukleinsäure sollte sofort verwendet oder bei -20°C gelagert werden.

2) Vorbereitung der Positivkontrolle

Die Positivkontrolle kann vor der Rehydrierung bei Raumtemperatur gelagert werden bis zu 12 Monate. Es sollte vor der Verwendung rehydriert werden durch Zugabe von 250 μl TE-Puffer oder nukleasefreiem H₂O, 15-20 Sekunden lang bei niedriger Geschwindigkeit vortexen und 15-20 Sekunden lang bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugieren. Sofort verwenden oder bei -20°C.

3) Real-Time PCR Mix Vorbereitung

A) Öffnen Sie die Vakuumverpackung und nehmen Sie den 8-Röhrchen-Streifens mit dem Reagenz heraus. Überprüfen Sie, ob sich das Pellet am Boden des Röhrchens befindet (Schneiden Sie die Anzahl der benötigten Röhrchen ab falls erforderlich). Wenn die bereitgestellten Röhrchen nicht mit Ihrem Instrument kompatibel sind, übertragen Sie das Reagenzpellet in ein optisches Röhrchen, das mit Ihrem Instrument kompatibel ist.

B) Öffnen Sie die Röhrchen und entsorgen Sie die Kappe(n) (nicht für Real-Time-PCR-Maschinen geeignet) und bereiten Sie den Reaktionsmix auf Eis wie unten beschrieben vor.

* Nukleasefreies Wasser kann als Negativkontrolle verwendet werden.

C) Verschließen Sie die PCR mit Kappen (Streifen), die für Real-Time-PCR geeignet sind(nicht im Lieferumfang enthalten).

D) Vortexen Sie die Röhrchen 10 bis 15 Sekunden lang bei niedriger Geschwindigkeit und zentrifugieren Sie sie 20 Sekunden lang bei 3000 U/min und platzieren Sie sie in einem Real-Time-PCR-Instrument.

4) RT-PCR-Setup

Stellen Sie das Reaktionsvolumen auf 25 μl ein und führen Sie das PCR-Amplifikationsverfahren wie unten beschrieben durch. Sammeln Sie die FAM- Fluoreszenz bei 60°C und wählen Sie KEINE als passive Referenz.

5) Ergebnis Analyse und Interpretation